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蛋白質印跡手冊11:影響免疫檢測的因素(上)

【字體: 時間:2014年06月23日 來源:默克密理博

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  影響免疫檢測的因素有很多,包括緩沖液、封閉、抗體、清洗、檢測底物等等。了解下列章節中提出的有關免疫檢測的概念,將有助于優化特定樣品的操作。

了解下列章節中提出的有關免疫檢測的概念,將有助于優化特定樣品的操作。

  • 緩沖液

最常用的兩種緩沖液是磷酸鹽緩沖液(PBS)和Tris緩沖液(TBS)。調整配方中緩沖液組分的各種改良配方已見諸期刊?;撼逡旱墓丶笫撬τ兄詒3摯固宓納锘钚?。因此,離子強度和pH值應相當接近生理狀態。PBS的配方(磷酸鹽總濃度10 mM)適用于廣泛的抗體和檢測底物。

在孵育過程中,裝有膜的容器應輕輕搖動?;撼逡旱牧坑ψ愎?,完全覆蓋膜,使其在緩沖液中自由漂浮。如果不止一張印跡放在容器中,緩沖液容量不足會導致印跡膜粘在一起。這將影響孵育溶液的充分接觸,導致各種假象,如背景高、信號弱和靈敏度不均勻等。

  • 封閉

要獲得有意義的結果,必須保證抗體只與感興趣的蛋白質結合,而不與膜結合。利用惰性蛋白、非離子去污劑,或無蛋白的封閉劑(如Bløk® noise-canceling試劑)來封閉膜上未被占據的位點,可減少抗體的非特異結合(NSB)。封閉劑與膜的親和力應高于抗體。它應填滿膜上未被占據的位點,但不會替換膜上的目標蛋白。最常用的封閉劑是牛血清白蛋白(BSA,0.2-5.0%)、脫脂牛奶、酪蛋白、明膠、吐溫20去污劑的稀釋液(0.05-0.1%)以及Bløk®試劑。研究表明,吐溫20去污劑對抗原有復性的作用,從而能夠提高特異抗體對抗原的識別(Van Dam等,1990;Zampieri等,2000)。其他去污劑,如Triton® X-100去污劑、SDS和NP-40,有時也會使用,但可能會太過劇烈而破壞了蛋白之間的相互作用。封閉劑通常溶解在PBS或TBS中。

與封閉相關的風險包括:選擇不適當的封閉劑或過量封閉會替換或掩蓋目標蛋白質。因此,封閉劑的正確選擇對成功的免疫檢測很關鍵。例如,奶粉不能用于生物素化或刀豆蛋白標記的抗體,因為牛奶中含有糖蛋白和生物素。在用磷酸化特異性抗體對磷酸化蛋白進行檢測分析時,如果采用粗蛋白制劑作為封閉劑,由于這些制劑中可能含有磷酸酶,而印跡上的磷酸化蛋白會被這些酶去磷酸化,就有可能會影響分析結果。研究表明,在封閉液中添加磷酸酶抑制劑可增強磷酸化特異性抗體的信號(Sharma和Carew,2002)。此外,適用于一種抗原-抗體組合的封閉劑可能不適用于其他組合。

封閉劑和檢測試劑之間的兼容性可通過操作1.5(第41頁)中介紹的斑點印跡方法來確定。封閉液被點樣在空白的PVDF膜上,而膜已在甲醇中浸潤,并在TBS中平衡。隨后在印跡上添加檢測試劑,孵育5分鐘,并曝光在X射線膠片上。暗斑的出現則表明封閉劑與檢測試劑不兼容(圖19,第42頁)。必須記住,與Immobilon®-P轉印膜相比,Immobilon®-PSQ轉印膜的表面積更高,孔徑更小,可結合更多的蛋白質。如果在標準的Western印跡操作中用Immobilon®-P轉印膜來替代Immobilon®-PSQ轉印膜,那么封閉液可能不足以飽和膜表面??贍芐枰嗟那逑床街櫪唇檔捅塵?。利用斑點印跡方法,可方便地優化封閉(第40頁)。

  • 抗體

在封閉之后,印跡與一個或多個抗體孵育。第一個抗體與目標蛋白結合,而第二個抗體與第一個結合。第二個抗體結合有酶或染料,可用來指示蛋白的位置。

盡管一抗能直接標記,但使用二抗有明顯的優勢。首先,不止一個二抗分子能夠與單個一抗分子結合,形成信號擴增。其次,標記的二抗(酶-抗體結合物)可用于大量不同特異性的一抗,從而不再需要標記多個一抗。

多克隆或單克隆的一抗都可使用。多克隆抗體通常是以抗血清或親和純化的抗體形式提供的。單克隆抗體是在腹水或組織培養液中表達的,可直接使用或進行親和純化。一定要記住,變性蛋白可能無法被天然抗原培育出的抗體所識別。在某些情況下,可能需要非變性凝膠來進行印跡??固逡曰撼逡漢頭獗找合∈?,以避免與膜的非特異結合??固逑∈鴕和ǔR舶哿康耐攣?0或另一種去污劑,以防止抗體的非特異聚集。許多發表的化學發光操作需要在封閉液和抗體稀釋液中添加0.1%(v/v)吐溫20。我們必須認識到,高于0.05%(v/v)的濃度有可能從膜上洗掉一些印跡的蛋白質。

提高吐溫20去污劑的濃度通?;嶠檔捅塵?。一種更簡單且更經濟的策略是降低抗體的濃度,特別是二抗(詳見圖12)??固灞匭胩匾煺攵閱康牡鞍?,不能與封閉液中的組分交叉反應,且應該是相對純凈的。其他蛋白質或聚集物形式的雜質會導致非特異性結合和背景增高。

免疫檢測是一種極其靈敏的方法。為了實現高的信噪比和最高的靈敏度,一抗和二抗的濃度應針對每種情況來優化。一般來說,高倍稀釋一抗或降低凝膠上的蛋白上樣量可減少非特異信號。高倍稀釋酶標記的二抗可最大限度降低整體的高背景。


一抗和二抗的最佳濃度也取決于檢測試劑的靈敏度。高靈敏度的試劑(檢測到飛克級)與低靈敏度的試劑(檢測到皮克級)相比,抗體用量可減少20倍??固迮ǘ鵲撓嘔【鲇詡觳獾孜锏睦尤繽?3所示。在使用最靈敏的檢測試劑(Luminata™ Forte試劑)時,過量的抗體導致高的非特異性和整體背景增高(左上)。在這種情況下,將一抗稀釋度從1:1,000提高到1:10,000,改善了信噪比。在使用沒那么靈敏的檢測試劑(中間和最下面一行)時,抗體需要更為濃縮,以產生相同的信號。

圖12. 二抗稀釋度的優化,利用Immobilon® Western化學發光HRP底物對ERK1進行免疫檢測。大鼠肝臟裂解液的兩倍稀釋物被上樣到每塊凝膠上。電轉后的蛋白質與兔抗ERK1抗體(1:1,000稀釋)以及HRP結合的山羊抗兔IgG(1:5,000、1:20,000和1:100,000稀釋,從左到右)雜交。

圖13. 檢測試劑越靈敏,需要的抗體越少。包含指定量A431裂解液的免疫印跡與不同濃度的GAPDH抗體(貨號 MAB374)雜交,如最上面一行,再與適當的二抗雜交。利用指定的Luminata™ HRP底物觀察條帶,并在X射線膠片上曝光5分鐘。在這三種檢測試劑中,Luminata™ Forte試劑最靈敏,Luminata™ Cresendo次之,最后是Luminata™ Classico試劑。

使用靈敏度較高的HRP底物,有三方面的優點:

1. 結果更佳:它產生更強的條帶,帶來更為定量的印跡(比較Luminata™ Cresendo和Forte底物在1:10,000稀釋度下條帶強度的增加)
2. 更快速:清洗印跡和添加新底物只需要10分鐘,而重復抗體孵育需要2.5小時。
3. 更便宜:HRP底物比抗體要便宜得多。

  • 清洗

清洗印跡,從膜上去除未結合的抗體,它們可能導致高背景和檢測不佳。通常使用吐溫20的PBS或TBS稀釋液(0.05% v/v),特別是當抗體制劑是粗制的,或高濃度使用時。如前所述,濃縮的去污劑溶液可能導致感興趣的蛋白質從膜上洗脫。對于高度純化的抗體,往往只使用緩沖液進行清洗。

所需的清洗次數最好根據實驗來確定。清洗太少會產生過多的背景,而清洗過度有可能洗脫抗體并降低信號。建議至少清洗三次,每次5分鐘。

在TBS清洗液中添加最多0.5 M NaCl和0.2% SDS,并將清洗時間延長至2小時,可降低頑固的背景。

(實際內容以《蛋白質印跡手冊》印刷版為準,如有錯漏,敬請諒解)

立即索取印刷版《蛋白質印跡手冊》

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