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蛋白質印跡手冊13:蛋白質鑒定(二)

【字體: 時間:2014年06月30日 來源:默克密理博

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  質譜(MS)是一種用于鑒定印跡上蛋白質的分析方法。用MS兼容的染料(考馬斯亮藍、氨基黑或Sypro®染料)對PVDF膜上的蛋白質進行染色后,目的條帶被剪下來,并進行胰蛋白酶消化。所產生的肽片段可用質譜法分析(Gharahdaghi等,1996;Bienvenut等,1999;Bunai等,2003)。

質譜分析

利用Immobilon® PVDF轉印膜進行質譜分析

質譜(MS)是一種用于鑒定印跡上蛋白質的分析方法。用MS兼容的染料(考馬斯亮藍、氨基黑或Sypro®染料)對PVDF膜上的蛋白質進行染色后,目的條帶被剪下來,并進行胰蛋白酶消化。所產生的肽片段可用質譜法分析(Gharahdaghi等,1996;Bienvenut等,1999;Bunai等,2003)。圖17顯示了一張MALDI-TOF圖譜,其中膜上消化的牛蛋白被成功鑒定為過氧化氫酶。

另一個要考慮的方法是直接在轉印的Immobilon® PVDF轉印膜上進行蛋白質譜分析。這種方法通常適用于2-D凝膠分離的蛋白質。通過平行處理,凝膠上的所有蛋白質同時被水解消化,并電轉到Immobilon® PVDF轉印膜上,隨后經過掃描,以查看肽段是否存在(Binz等,1999;Bienvenut等,1999;Bienvenut等,2003)?;蛘?,采用另一種被稱為“化學印刷”的方法(Wallace等,2001;Gooley等,1998),首先將雙向分離的蛋白轉移至PVDF膜上并觀察,然后直接在斑點上分配極少量的胰蛋白酶進行消化(Sloane等,2002)。在這兩種方法中,膜都會被噴上基質,并通過MALDI-TOF MS直接掃描。通過肽質量指紋圖譜分析來鑒定蛋白質。圖18顯示了2-D分離后的人血漿蛋白轉移到Immobilon®-PSQ轉印膜上,并獲得兩個MALDI-TOF圖譜,以鑒定膜固定化的蛋白質。

圖17. 肝臟蛋白的考馬斯亮藍染色印跡中一條帶的MALDI-TOF圖譜,利用操作5.1。膜上蛋白質消化,第57頁(Bienvenut等,1999)。此蛋白質被鑒定為牛過氧化氫酶,有著6.4e+06的MOWSE分數和34% 覆蓋度。數據在Bruker® Autoflex™質譜儀上獲得。搜索是利用Protein Prospector進行的。

圖18. 人血漿通過雙向電泳分離,并轉移到(左)Immobilon®-PSQ轉印膜和(右)MALDI-TOF,直接收集自胰蛋白酶消化蛋白的膜表面。人血漿通過雙向電泳分離,電轉到Immobilon®-PSQ轉印膜上,并粘附到MALDI靶板上。胞內胰蛋白酶的消化在膜表面直接開展。消化需要納升級的酶,并利用ChIP™通過按需壓電噴墨裝置微噴在膜表面上(Proteome Systems和島津公司)。由此產生的肽段通過AXIMA™-CFR(島津公司)來分析。MALDI-TOF MS并利用肽質量指紋圖譜鑒定。肽段直接在膜表面分析,其中MALDI基質在消化前被微噴在消化蛋白的上面。數據由J.L. Duff、F.G. Hopwood、C.J. Hill、A.A. Gooley博士友情提供(Proteome Systems,澳大利亞悉尼)。

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