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蛋白質印跡手冊14:濕轉操作詳解[創新技巧]

【字體: 時間:2014年07月09日 來源:默克密理博

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  下列操作介紹了利用槽轉印系統將蛋白質從聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)轉移到Immobilon® PVDF轉印膜的標準步驟。關于更多信息,請查看您的槽轉印系統附帶的操作指南。

手冊的這一節是最常用的蛋白質印跡操作的概要。這些方法是通用的,適用于所有市售的檢測試劑。它們可利用眾多技巧來優化,包括本節中的技巧。這些優化技巧是默克密理博公司多年來關于轉印膜和印跡經驗的結晶,也來自參考文獻和客戶的反饋。

提示:乙醇或異丙醇可替代轉印緩沖液中的甲醇。
提示:轉印緩沖液中的SDS(最高0.05%)可提高轉移效率,但也有可能降低膜對蛋白的截留。
提示:預切好的Immobilon® 轉印膜與所有標準尺寸的迷你膠及常用的電泳系統兼容(第8和9頁的表)。
            建議 – 在槽轉印之前預冷轉印緩沖液。
提示:較厚的凝膠或較大的蛋白質可能需要較長的轉印時間或增加場強。真正的轉印條件應針對每個系統來優化。
提示:轉印緩沖液中的甲醇(8-20%)降低蛋白從膜上的洗脫效率,但改善PVDF轉印膜的吸附。
提示:由于PVDF的疏水性質,膜需要用醇類浸潤。
提示:Tris甘氨酸緩沖液會在N端測序中產生較高的背景。如果蛋白質要通過Edman降解來測序,可使用CAPS或TBE緩沖液。
提示:在分析較小分子量的蛋白質時,可用0.2 μm Immobilon®-PSQ轉印膜來替代0.45 μm Immobilon®-P轉印膜。
提示:在熒光檢測方法中使用0.45 μm Immobilon®-FL轉印膜

蛋白質轉印

操作1.1 電泳轉?。翰郟ㄊ┳?/FONT>

下列操作介紹了利用槽轉印系統將蛋白質從聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)轉移到Immobilon® PVDF轉印膜的標準步驟。關于更多信息,請查看您的槽轉印系統附帶的操作指南。

必需的設備和溶液

• 包含已分辨蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠。
• Immobilon® PVDF轉印膜,切成與凝膠相同的大?。ù腥苯?,以便定位)。
• 兩張Whatman® 3MM濾紙或類似產品,切成與凝膠相同的大小。
• 兩塊泡沫墊(例如,Scotch Brite® 墊)。
• 槽轉印系統,可容納凝膠。
• 甲醇,100%
• Milli-Q® 水
• Tris/甘氨酸轉印緩沖液:25 mM Tris堿、192 mM甘氨酸、10%(v/v)甲醇,pH 8.3;或CAPS緩沖液:10 mM 3-環己胺-1-丙磺酸(CAPS)、10%(v/v)甲醇,pH 11(用NaOH調整)。

注意:兩種緩沖液都制備成10X儲液,在使用前與甲醇混合。

準備

1. 準備足夠的轉印緩沖液來裝滿轉印槽,以及另外200 mL來平衡凝膠和膜,并潤濕濾紙。
2. 從轉印夾中取出凝膠;切掉積層膠和點樣孔。
3. 將凝膠浸泡在轉印緩沖液中10至30分鐘。
4. 將濾紙浸泡在轉印緩沖液中至少30秒。
5. 準備轉印膜:
a. 將膜在甲醇中浸泡30秒。膜應均勻地從不透明變成半透明。
b. 小心將膜放入Milli-Q® 水中,浸泡2分鐘。
c. 小心將膜放入轉印緩沖液中,至少平衡5分鐘。

轉印堆積層的組裝

1. 打開凝膠支架轉印夾。
切記:為了確保均勻的轉移,請在堆積層中每一層的表面小心滾動移液管或攪拌棒,以去除氣泡。不要施加過大的壓力,以防止損壞膜和凝膠。
2. 將泡沫(纖維)墊放在卡盒的一側。
3. 將一張濾紙放在泡沫墊上。
4. 將凝膠放在濾紙上。
5. 將膜放在凝膠上。
6. 將第二張濾紙放在堆積層上。
7. 將第二個泡沫墊放在濾紙上。
8. 蓋上凝膠支架轉印夾。

完整的轉印堆積層應如下所示:

蛋白質轉印

1. 將凝膠支架轉印夾放入轉印槽中,讓凝膠一側面對陰極(-),膜一側面對陽極(+)。
2. 在槽內加入足夠量的緩沖液,以覆蓋轉印夾。
3. 將黑色陰極引線(-)插入轉印裝置的陰極插孔,將紅色陽極引線(+)插入陽極插孔。
4. 將陰極引線和陽極引線連接到相應的功率輸出。
5. 如果有的話,根據制造商的指引設置轉印槽的冷卻裝置。
6. 開啟系統,以6-8 V/極間距離運行1-2小時。按照轉印槽制造商的指引,并參考蛋白質從凝膠轉移到膜上(第16頁),了解優化細節。
7. 在轉印完成后,從轉印槽中取出轉印夾。
8. 利用鑷子,小心拆卸轉印堆積層。

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