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蛋白質印跡手冊17:蛋白質觀察[創新技巧]

【字體: 時間:2014年08月28日 來源:默克密理博

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  下列操作介紹了對固定在Immobilon® PVDF轉印膜上的蛋白質進行染色的典型步驟。注意:在觀察一塊染色的印跡時,當膜還是濕的時,對比度是最好的。在照相時,使用濕的印跡和透過膜的光。

下列操作介紹了對固定在Immobilon® PVDF轉印膜上的蛋白質進行染色的典型步驟。注意:在觀察一塊染色的印跡時,當膜還是濕的時,對比度是最好的。在照相時,使用濕的印跡和透過膜的光。

提示:在免疫檢測之前只能使用可逆染料或透照。
提示:為了觀察微弱的條帶,將甲醇濃度提高到40%。

1 通過透照法觀察

透照法是一種非破壞性的可逆技術(Reig和Klein,1988)。這種方法是基于PVDF膜浸泡在甲醇中,會從不透明變為半透明。20%的甲醇會使包被有蛋白質的膜浸濕,而無蛋白質的區域不會。

提示:在開發一種新的轉印操作或處理一種新的樣品類型時,凝膠應被染色,以驗證所有蛋白質是否從凝膠上徹底洗脫。
放置在光盒中,蛋白條帶會表現為透明的區域。與照相結合使用時,檢測靈敏度與考馬斯亮藍染料相當。

必需的設備和溶液
• 20%(v/v)甲醇
• 淺托盤,能容納膜
• 白色光盒
• 黑紙

步驟
1. 利用操作1.7 膜干燥方法(第44頁)中的一種方法,讓印跡徹底干燥。
2. 在托盤中加入足量20%的甲醇,以覆蓋印跡。
3. 將印跡放在20%甲醇中5分鐘。
4. 將印跡放在光盒中,用一張黑紙遮蓋印跡周圍的區域。
5. 條帶變成透明區域,而背景不透明(圖10,印跡A,第24頁)。
6. 如果需要永久記錄,對濕的印跡照相。
7. 當所有甲醇干燥后,印跡將恢復成它原先的樣子。

2 通過可逆染色觀察

麗春紅
這種染料產生淺色背景下的粉紅條帶。

必需的設備和溶液
• 染料:0.2%麗春紅、1%乙酸。按1:10用1%(v/v)乙酸稀釋儲液(20%染料,溶于30%(w/v)三氯乙酸和30%(w/v)磺基水楊酸)而制備。
• 甲醇,100%。
• 0.1 N NaOH。
• Milli-Q® 水。
• 淺托盤,能容納膜。

步驟
1. 如果印跡是干燥的,在100%甲醇中浸濕。
2. 在托盤中加入足量的染料,以覆蓋印跡。
3. 將印跡放入染料中,搖動1分鐘。
4. 取出印跡,用Milli-Q® 水徹底沖洗,直至達到所需的對比度。
5. 若要徹底去除染料,用0.1 N NaOH清洗印跡。


CPTS(酞菁銅四磺酸)
這種染料產生淺色背景下的翠藍色條帶。

必需的設備和溶液
• 染料:0.05%(w/v)CPTS,溶于12 mM HCl。
• 脫色液I:12 mM HCl。
• 脫色液II:20%(v/v)甲醇。
• 甲醇,100%。
• 0.1 N NaOH。
• Milli-Q® 水。
• 蛋白脫色液:0.5 M NaHCO3。
• 淺托盤,能容納膜。

步驟
1. 如果印跡是干燥的,在100%甲醇中浸濕。
2. 在托盤中加入足量的染料,以覆蓋印跡。
3. 將印跡放入染料中,搖動1分鐘。
4. 將印跡放入脫色液I中,去除多余的染料,達到所需的對比度。
5. 若要徹底去除背景中的染料,用脫色液II清洗印跡。
6. 若要使蛋白脫色,在蛋白脫色液中搖動,直至染料去除。

3 通過不可逆染色觀察

考馬斯亮藍R染料
這種染料在淺色背景下產生深色條帶。
切記:這種染料會干擾免疫檢測。

必需的設備和溶液
• 染料:0.1%(w/v)考馬斯亮藍,溶于50%(v/v)甲醇和7%(v/v)乙酸。
• 脫色液I:50%(v/v)甲醇和7%(v/v)乙酸。
• 脫色液II:90%(v/v)甲醇和10%(v/v)乙酸。
• 甲醇,100%。
• Milli-Q® 水。
• 淺托盤,能容納膜。

步驟
1. 如果印跡是干燥的,在100%甲醇中浸濕。
2. 在托盤中加入足量的染料,以覆蓋印跡。
3. 將印跡放入染料中,搖動2分鐘。
4. 取出印跡,用Milli-Q® 水短暫沖洗。
5. 將印跡放入脫色液I中,搖動10分鐘,以去除過量的染料。
6. 將印跡放入脫色液II中,搖動10分鐘,以徹底使背景脫色。

氨基黑
這種染料在淺色背景下產生深色條帶。
切記:這種染料會干擾免疫檢測。

必需的設備和溶液
• 染料:0.1%(w/v)氨基黑,溶于25%(v/v)異丙醇和10%(v/v)乙酸。
• 脫色液:25%(v/v)異丙醇和10%(v/v)乙酸。
• 甲醇,100%。
• Milli-Q® 水。
• 淺托盤,能容納膜。

步驟
1. 如果印跡是干燥的,在100%甲醇中浸濕。
2. 在托盤中加入足量的染料,以覆蓋印跡。
3. 將印跡放入染料中,搖動2分鐘。
4. 取出印跡,用Milli-Q® 水短暫沖洗。
5. 將印跡放入脫色液中,搖動5-10分鐘,以去除過量的染料。

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