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蛋白質印跡手冊22:故障排查(上)[創新技巧]

【字體: 時間:2014年09月11日 來源:默克密理博

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  蛋白質印跡出了問題?沒關系,下面的troubleshooting指南一定能幫助你找出可能的原因,并為你提供補救辦法。

1. 斑點(過濾)印跡

癥狀

可能的原因

補救辦法

樣品濾過膜的流速慢或無法濾過

真空不夠

確保印跡裝置已正確關閉,且密封完好。

確保真空源(如泵)運行正常。

用高品質的實驗室膠帶密封所有開孔。提高真空水平。

膜的孔被堵塞

離心或過濾樣品,以去除顆粒。

用緩沖液稀釋粘稠的樣品。

在印跡上觀察到很少蛋白或無蛋白

上樣到膜上的蛋白質不夠

最大限度減少樣品稀釋,過濾更多的樣品。

去污劑(如SDS)可能抑制低分子量蛋白質與膜的結合

如有可能,去除去污劑。

染色不夠靈敏

使用更加靈敏的染料。

染色的印跡不均一

膜的結構被濾紙壓縮

在印跡裝置中放置第二張膜,以?;そ郵昭返哪?。

氣泡截留在膜的內部

將膜放在甲醇表面,預潤濕膜。浸沒膜可能會截留空氣。

膜未在甲醇中預潤濕

膜必須用甲醇預潤濕;整張膜應均勻地從不透明變為半透明。

樣品中有氣泡

小心移液孔中的樣品,以避免氣泡形成。

上樣量不夠

樣品必須覆蓋整個暴露的膜區域。

膜上面的蛋白彌散

孔中的樣品滲漏

在過濾前確保印跡裝置正確組裝、關閉和密封。

膜背面的蛋白彌散

超過了膜的容量

減少孔中的蛋白上樣量。

2. 半干轉印或槽轉印

癥狀

可能的原因

補救辦法

條帶彌散/扭曲

膜未在甲醇中均勻潤濕

整張膜必須用甲醇預潤濕;整張膜應均勻地從不透明變為半透明。

膜下以及堆積層的其他各層之間存在氣泡

在組裝堆積層時,利用移液管或攪拌棒,輕柔滾動以去除任何截留的氣泡。

凝膠和膜之間的接觸不均勻

確保整張凝膠和膜的表面有良好接觸。

在轉印過程中產生太多熱

運行的溫度不應超過20°C。對于槽轉印,預冷緩沖液,或在冷室中開展轉印。對于半干轉印,要么縮短運行時間,增加濾紙數量,要么降低電流。

在半干轉印過程中濾紙變干

在轉印之前確保濾紙徹底濕透,或使用更多濾紙。確保堆積層在15分鐘內組裝好。

蛋白質轉印太快;蛋白質累積在膜表面

降低電場強度。

信號弱

蛋白質穿過膜

將電壓降低最多50%,增加蛋白質必須與膜接觸的時間。

高負電荷的蛋白質(由于天冬氨酸和谷氨酸含量高)往往在電場中非??燜俚匾貧?。降低電壓,以減慢這些蛋白質的遷移。

凝膠中SDS的存在可能抑制蛋白質的結合。在轉印緩沖液中平衡凝膠至少15分鐘。

轉印緩沖液中甲醇濃度太低,不利于SDS的去除。將甲醇增加至15-20%,特別是對于較小分子量的蛋白質。

膜必須用甲醇預潤濕;整張膜應均勻地從不透明變為半透明。

蛋白質保留在凝膠中

如果轉印緩沖液中的甲醇濃度過高,它會去除蛋白質中的SDS,導致蛋白沉淀在凝膠中。這會降低高分子量蛋白質的轉移。如果蛋白沉淀是個問題,那么可在轉印緩沖液中添加SDS0.01%-0.05%),以提高溶解度。此外,過量甲醇往往收縮或收緊凝膠,從而抑制大分子量蛋白質的轉移。

蛋白質的等電點處于或接近轉印緩沖液的pH

等電點與轉印緩沖液的pH值相同的蛋白質將無凈電荷,因而不會在電場中遷移。為了促進轉移,嘗試更高pH值的緩沖液,如10 mM CAPS緩沖液(pH 11),包括10%甲醇,或較低pH值的緩沖液,如乙酸緩沖液。

當凝膠和/或轉印緩沖液中使用尿素時,檢測不佳

通過循環的緩沖液設置,或在冷室中運行轉印,來降低溫度。尿素受熱會引起蛋白質的氨基甲?;?,從而改變蛋白質中氨基酸的電荷。這會影響抗體識別和結合所必需的表位。

蛋白質轉移不徹底

對凝膠染色,以檢查殘留蛋白質。如果轉移不徹底,請檢查您的轉印技術。

蛋白質保留不佳

一旦轉印完成,確保膜徹底干燥,以實現蛋白質的最佳結合和固定。這應在下游檢測之前完成。

無信號

蛋白質未轉移

檢查轉移過程中凝膠和膜的方向。使用預染的分子量標準品來監控轉移。

小分子量蛋白質的轉移不佳

蛋白質保留不夠,SDS干擾小分子量蛋白質的結合

換用Immobilon®-PSQ轉印膜。去除轉印緩沖液中的SDS。

轉印緩沖液中的甲醇濃度低

在轉印緩沖液中使用較高比例的甲醇(15%-20%)。

蛋白質結合的時間不夠

較低電壓可優化小蛋白與膜的結合。

電流不能穿過膜。

將膜和濾紙切成與凝膠相同的大??;切勿超出。

大分子量蛋白質(~ >80 kDa)的轉印不佳

甲醇濃度過高

甲醇濃度降低至10%v/v)或以下能讓凝膠溶脹,從而協助大分子量蛋白的轉移。而且,較低比例的甲醇也會減少蛋白的SDS損失,減少凝膠中的蛋白沉淀。對于SDS對膜結合的干擾,>200 kDa的蛋白質不如<100 kDa的蛋白質靈敏。

正電荷蛋白質的轉移不佳

蛋白質在轉移緩沖液中帶正電荷;蛋白質向陰極移動。

反轉轉印堆積層,讓Immobilon® 轉印膜在凝膠的陰極一側。

半干轉印不佳

電流繞過凝膠堆積層

確保膜和濾紙切成與凝膠相同的大小,切勿超出。

各種大小的蛋白質轉移不佳

轉移大蛋白和小蛋白需要不同的條件

請參考“寬分子量范圍蛋白質的轉移可能需要多步的轉移”(T. Otter et al., Anal. Biochem. 162:370-377 (1987)

在半干轉印中使用三緩沖液系統。

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