美國國家微生物組計劃啟動:真正的新技術在哪里?

【字體: 時間:2016年05月17日 來源:生物通

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  “國家微生物組計劃”是奧巴馬政府繼腦計劃、精確醫學、抗癌“登月”之后推出的又一個重大國家科研計劃,無疑為目前火熱的微生物組研究又加了一把火。但這一項目想要順利開展并不容易,微生物的數量龐大,種類繁多,要進行分析難上加難,那么真正的新技術在哪里呢?

  

——美國白宮宣布啟動“國家微生物組計劃”,研究地球上的多種微生物菌群

生物通報道:2007年底美國NIH投入1.15億美元啟動了“人類微生物組計劃”;

2012-2014年間,聯邦政府對微生物組學的研究資助大增,2014財年的聯邦投資是2012財年的3倍,在3年間的總投資超過9.22億美元;

時間又來到了2016年5月13日,美國白宮宣布啟動“國家微生物組計劃”,計劃在財政年度2016-2017間準備投入1.21億,其中包括來自美國NIH的2000萬資助,美國國家科學基金會 (NSF)1600萬資助,NASA的1250萬資助,美國能源部的1000萬資助,以及美國農業部的2390萬美元的資助。這一項目目的在于通過分析人體內外,植物和其它生態系統中微生物,更好的了解這些生物在人體和環境健康中扮演的重要角色。

“這對于該領域的研究人員來說,是一個值得慶祝的偉大日子”,科學大咖J. Craig Venter(J. Craig Venter研究所創始人)對此表示。J. Craig Venter研究所早在2004年就發表了關于馬尾藻的基因組研究。目前,他的研究組已在全球收集了數千份海洋資源的樣本。

相比于其它項目“緊巴巴”的資金資助,微生物組近年來可謂是“風生水起”,在奧巴馬政府繼腦計劃、精確醫學、抗癌“登月”之后推出的這一重大國家科研計劃無疑為目前火熱的微生物組研究又加了一把火。

這也就可以解釋了為何去年上半年,湯森路透統計的最高引用的熱門論文出自微生物組研究領域盤點2015上半年最熱門生物類論文,而且這種研究界的這種熱情也感染了公眾,紐約時報都曾以頭條宣告“We Are Our Bacteria”。

在這十年里,科學家們對于人體微生物的了解逐漸加深,對人體微生態的多樣性和分布也認識不少了,但是我們對于微生物組如何與宿主交互,環境微生物的影響等微生物組生物學仍然知之甚少。

這也就是這一新項目啟動的主要原因,目前“國家微生物組計劃”有三大目標:首先,支持跨學科研究,以回答多樣化生態系統中微生物組的基本問題,如什么是健康的微生物組;其次,開發檢測、分析微生物組的工具,如實時檢測空氣、土壤、水或人體微生物的手持傳感器;第三,培訓更多的微生物組相關工作人員。

但這一項目想要順利開展并不容易,首先雖然有顯微成像,低成本高通量基因測序技術的發展,以及多種數據分析的生物信息學工具躍進,但是微生物的數量龐大,種類繁多,尤其是土壤,海洋和大氣中的微生物群落,收集分析并不容易,一般來說在微生物組樣品中,宿主DNA占了絕大部分,有時甚至高達99%。 在實際樣品中,微生物組DNA往往跟我們不想測序的東西裹在一起。

那么如何很解決這些問題,微生物組學真正的新技術在哪里呢?

樣品收集與保存

來自芝加哥大學的微生物生態學家 Jack Gilbert曾表示,“微生物多樣化多到可怕,而且復雜。任何特殊處理都會改變其組成部分?!奔詞故俏⑸錁鶴钚〉謀浠蛘呦嘍苑岫雀謀?,也會極大的干擾群體比對,因此樣品收集和儲存方法引起的變化越小越好。

原始樣品的保真性從收集樣品的那一刻就開始了。第一步需要確保的是獲得的是一個均勻的樣品,2015年,一組研究人員完成了一項人腸道微生物組的研究,他們將液氮糞便樣品通過研缽及研杵搗碎,使之成為粉末狀小樣品,然后轉移到試管中,−80°C儲存。比較于之前的方法,這種制備樣品的方法能減少微生物組成上出現的可變性。

而土壤樣品具有更加復雜的組分,因此科學家們建議將土壤樣品放到攪拌機中,充分攪碎顆粒物。他們也建議在初次收集樣品后再進行多次等分分裝,因為多次反復凍融會破壞核酸,這一點其實很多實驗室研究人員都知道。比如研究人員可以采用無菌一次性活檢鉗(biopsy punch)從一個更大的原始樣品中收集幾乎相同大小的凍存糞便顆粒,然后直接將這些顆粒放入含有核酸裂解液中的提取管中。這種方法就是對原始樣品進行等分,但可以為科學家們節約整整一次凍融重復循環。

此外,2014年,美國福賽思研究所、麻省綜合醫院(MGH)和哈佛大學公共衛生學院等處的科學家,開發出一種新的方法,收集用于基因組和轉錄組分析的唾液與糞便。該方法不需要專業人員和設施,同時還能保持樣品的完整性。

研究人員設計了固定劑的選擇和取樣流程(如下圖)??扇?名受試者在家里收集微生物樣品,然后將其運至實驗室進行多種類型的分子分析。盡管采用不同的取樣方法,微生物種類、基因和基因轉錄組成,在所有樣品中都是一致的。隨后對這些樣品進行的分析表明,測量的人類微生物組的功能潛力和功能活性之間存在著有趣的異同點。在這項研究中是目前為止,結合表型分類學、宏基因組學和宏轉錄組數據譜,進行的第一個人類微生物組研究。結果詳細描述了腸道菌群基因組潛能和基因表達之間的關系,驗證了在受試者收集和運輸的樣品中開展宏轉錄組研究的可行性。

對于樣品的保存,低溫凍存?;た贍苡兄諮返謀4?。在比較儲存樣品和新鮮樣品中的微生物組成之前,可以采用一種快速的方法,來評估?;ぜ戀淖饔?,那就是檢測一下樣品DNA的量,如果DNA量不足,那么你采用的方法也許并不適用于這種微生物的保存。


RNAlater最初是作為一種RNA保存劑,由Qiagen和Thermo Fisher等廠家開發出來的(前者當地價格為:50mL的78美元,250mL的324美元;后者當地價格為100mL的125美元,500mL的386美元),現在可以用于保存DNA。

RNAlater是特殊的樣品儲存液,只要在采樣后立即將新鮮樣品浸入這種液體試劑,RNlater可以迅速滲透到組織或其他生物樣本中,穩定并?;NA完整而不被降解,確保下游分析得到的數據真實反應樣品的表達信息。RNAlater:徹底告別RNA降解的煩惱

人類微生物組計劃(Human Microbiome Project)的參與研究人員,來自哈佛大學的計算生物學家Curtis Huttenhower與他的同事們發現在樣品收集后,如果沒有冰箱,那么可以加入這種?;ぜ潦褂?。

不過一些用戶也報告了RNAlater的缺陷,雖然RNAlater不可燃,因此可以用于樣品運輸,但是這種?;ぜ粱嶠檔虰acteroidetes 和 Ruminococcaceae 兩種細菌新鮮提取后的菌群數量。另外就是如果想獲得樣品高RNA產量,那么就必須先將其去除。Ganz表示,“RNAlater會妨礙樣品正常形成顆粒沉淀,因此在去除RNAlater之后,還必須磷酸鹽緩沖液進行清洗?!?/p>

此外,Woods Hole海洋研究所海洋生物化學家Mak Saito也指出,RNAlater還有一個問題,那就是其高鹽含量,因此在一些實驗中會令樣品清洗成為問題。Saito曾采用這種溶液保存海洋微生物組中的蛋白組成。

對于一些類型的實驗樣品來說,如果加入低溫凍存?;ぜ輛突崠蠓雀謀湮⑸鎰槌?,這樣做劃不來,比如土壤樣品。而對糞便樣品而言,有時低溫凍存也許并不合適,比如說,用于治療艱難梭菌感染的樣品能在室溫下保存長達6個小時,而且還不會引起治療療效發生顯著變化。

測序技術

高通量基因測序技術無疑是微生物組研究的一大依靠,但是對于紛繁復雜的微生物組來說,測序技術工具還需不斷的開發改進,去年年底,斯坦福大學的研究人員首次開發出了一種新測序技術,用于分析人類腸道微生物組,克服了短讀取測序的技術限制。

他們將Illumina長讀取技術(TruSeq Synthetic Long-Reads)與計算工具結合起來,克服了短讀取測序的技術限制,獲得了一名男性腸道微生物組的清晰圖譜。

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目前通常是通過短讀取測序獲得一小段一小段的信息,為了改善這一問題,研究人員采用新方法,將較大的基因組片段裝訂在一起。首先用復雜的算法先將小片段組裝成10,000-base片段,再將10,000-base片段組裝成更長的片段,然后拼出整個基因組。研究指出,將Illumina長讀取技術與短讀取測序相結合,能夠更加精確和全面的分析宏基因組樣本,更容易在人、動物、植物、水和土壤中建立致病菌菌株的進化史。

但是目前一些科學家也提出,DNA提取試劑盒、化學試劑和實驗室環境中的雜菌很容易造成污染,影響微生物組分析的結果。

研究人員發現,沒有污染的話對照樣本應該只有一種菌,但有時卻出現了270種不同的細菌。與高生物量的樣本相比(糞便樣本),來自血液或肺部的低生物量樣本尤其容易受到污染。

為此,研究人員建議研究者們在研究低生物量樣本時采取一些額外的步驟。比如使用陰性對照鑒定可能污染樣本的雜菌,進行過濾或富集以增大初始材料中的生物量,在樣本收集的時候盡量降低污染的可能。

信息分析工具

在分離和測序細菌核酸之后,我們需要從數據中提取有效的信息,這并不是一件容易的事兒。微生物組研究者一般有兩個選擇:16S rDNA測序和宏基因組測序。16S rDNA測序可以展現樣本中的微生物種類和豐度,反映微生物多樣性的大規模改變。而宏基因組測序可以揭示微生物群體的代謝潛能,幫助人們組裝不同微生物的基因組。

16S rRNA分析最常用的工具是開源的QIIME和Mothur。當然市面上也有商業化的程序包,比如Thermo Fisher公司的Ion 16S Metagenomics Kit。這是一個基于網頁和云端的免費程序包。過去的微生物組研究主要使用16S rDNA測序。隨著測序成本的直線下降,針對整個菌群的宏基因組測序越來越受到青睞,因為這一技術能夠提供更全面的基因組和功能信息。

哈佛大學公共衛生學院的Eric Franzosa為宏基因組數據分析開發了HUMAnN2。第一代HUMAnN主要是根據宏基因組或者宏轉錄組數據,分析微生物通路在群體中是否存在。也就是說,給HUMAnN提供微生物群落的DNA或RNA序列,它就會告訴你這個群體能夠執行什么樣的分子功能。HUMAnN2在HUMAnN的基礎上進行了拓展,將微生物與特定活性關聯起來。

MetaPath也是一個用于宏基因組數據分析的重要工具。該工具由馬里蘭大學的副教授Mihai Pop開發,可以根據宏基因組數據分析特定群體在不同條件下的代謝變化。舉例來說,Pop的研究團隊對胖人和瘦人進行微生物組研究,通過MetaPath鑒定了脂肪酸生物合成通路的差異。微生物組研究手冊(信息學工具)

宏基因組研究通常是從環境中收集微生物和病毒樣品,然后將這些樣本破碎,把它們的基因組DNA降解成片段,最后通過測序儀進行分析。宏基因組分析比一般的基因組分析需要更多的借助計算機技術,因為宏基因組分析處理的是不同基因組的混合物,而不是單純的同質微生物種群。宏基因組分析產生的數據比一般基因組分析多得多,這是這一研究領域面臨的一大挑戰。

常用的一些工具,如MEGAN5主要用于MEtaGenome ANalyzer,最初是在2007年開發出來,用于識別長毛猛犸象骨中DNA測序研究的微生物污染。MEGAN5是發布的最新版本,除了可以幫助進行分類分析,也可以快速比較多個數據集,區分宏基因組中基因的功能,此外還提供元數據metadata支持和數據可視化的新途徑。

此外,近期Nature Methods雜志發布了一個名為TruSPADES的強大工具,可以大大提升研究者們測序宏基因組的能力。這種算法能將Illumina測序儀生成的300bp短讀取,合并成大約1萬bp的基因組片段(Synthetic Long Reads)。如果說用短讀取相當于語句,那么長片段就是整章文字。顯而易見,把整章文字還原成一本書要容易得多。

TruSPADES主要是先給100-300bp的短讀取裝上條碼,然后通過de brujin 圖把這些片段組裝起來,生成Synthetic Long Reads。這種低成本的方法可以更好的確定相連片段,獲得更長更準確的長測序片段。


題外話:

雖然微生物組熱潮鋪天蓋地,但是一些科學家認為這其實掩蓋了其中的風險?;毓酥暗鬧種幀白檠А比任頤強梢鑰吹?,技術進步賦予了人們分析基因組、蛋白質組、代謝組的能力,于是便有大量研究將這些分子的狀態與人體健康聯系起來。然而,這些研究的后續工作往往后繼無力,情況反而越來越復雜。

此前Nature雜志曾經刊文,對微生物組熱潮進行了反思。文章指出,在接受一項新結論之前,我們應該首先提出五個問題:

研究有沒有檢測到有意義的差異?

微生物組圖譜主要依賴16S rRNA分析,能提供門、屬、種的信息,但這種分類還不夠細。舉例來說,有研究鑒定了與糖尿病有關的微生物組,是細菌不同門之間呈特定比例,這未免太過于寬泛。這相當于是認為100只鳥和25只蝸牛組成的鳥舍等同于有8條魚和2只烏賊的水箱,只因為鳥舍和水箱里的脊椎動物和軟體動物之比都是4:1。另外,就算是同一個屬的微生物,所含基因也往往大相徑庭。

如今的技術其實可以做到更細致的分類,我們可以通過破譯“代謝網絡”來理解微生物組進行的生化反應,并在此基礎上鑒定對健康有影響的基因組合。不過這就要求研究者對整個網絡有一個透徹的了解。

研究是否明確了因果關系?

在鑒定疾病相關微生物組時,我們需要確定這種關系到底是不是因果關系,因為這種特別的微生物組有時可能只是個副產物。

2012年有一項研究發現,住在養老院里的老人微生物組與住在社區里的老人不同,而且這種差異與體質強弱。作者在考慮了多種因素后指出,飲食能夠改變微生物組進而影響健康狀況。這種結論的確與數據相符,但研究者卻沒能反向證明這樣的因果關系。因為可能影響微生物組的因素很多,比如免疫系統比較不活躍,消化能力較弱等等。

作用機制是什么?

我們都知道,相關性并不等同于因果關系。不過存在相關性,多半意味著某種因果關系的存在,這需要我們努力去發掘。

現在,研究者們可以通過設計,精確限定微生物組中的成分,建立缺乏某一類微生物的菌群,或者利用“芯片上的器官”測定微生物組的生化活性。這樣的方法能夠幫助我們確定,某一種微生物組對人體健康的影響。

研究是否足以反映真實情況?

不過,就算微生物組在實驗中能夠影響健康,也可能并不是造成患者癥狀的主要原因。

舉例來說,微生物組研究往往使用無菌小鼠,以便引入實驗性的菌群。但是這些小鼠并不能代表動物的天然狀態,缺乏微生物組的它們其實并不健康。因此,實驗結果并不一定符合動物的天然應答。另外,小鼠的生活環境與人類差異很大,有關微生物組的實驗結果也許并不能很好的用于人類。

結果是否可能有別的解釋?我們有充分的理由相信,細菌正在通過多種途徑對我們施加影響。但是也有許多其他因素(可能更重要)在起作用,比如飲食。在把某種微生物組與疾病關聯起來之前,明智的做法是,把所有可能的因素都納入考慮。

參考文獻:

Methods for Improving Human Gut Microbiome Data by Reducing Variability through Sample Processing and Storage of Stool

Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut

Examination of Microbial Proteome Preservation Techniques Applicable to Autonomous Environmental Sample Collection

TruSPAdes: barcode assembly of TruSeq synthetic long reads

Synthetic long-read sequencing reveals intraspecies diversity in the human microbiome

Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses

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